Nat Commun︱温度周期驱动生物钟基因进化的新机制：timless多态性
撰文︱陈骋昊
责编︱王思珍
生物钟是生物体为适应地球自转而产生的昼夜变化而产生的体内计时系统。生物钟通过分子水平上生物钟核心元件（clock、cycle、timless和period）的转录/翻译反馈回路维持以24小时为周期的动态平衡，是生物体在无外界环境因子作用的情况下依然能维持昼夜节律的分子基础。在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中CLOCK/CYCLE蛋白作为正向因子激活核心钟基因period/timless的转录和翻译，而PERIOD（PER）和TIMELESS（TIM）蛋白则作为负调控因子，通过与CLOCK/CYCLE相互作用，关闭自身转录。
生物钟与外界环境相互作用，以确保生物体选择最佳时机进行特定的节律行为。自然界中光照和温度都呈昼夜周期性变化，因此是同步化（synchronization）生物钟的关键授时因子（Zeitgeber，ZT）。在分子水平上，光通过激活隐花色素（CRYPTOCHROME，CRY）与TIM结合并启动泛素途径降解TIM，使得生物钟得以重置。对另一因子即温度如何导引（entrainment）生物钟的了解集中于神经环路水平[1-3]，而对其分子机制的了解较少。
2022年3月31日，德国明斯特大学神经与行为研究所Ralf Stanewsky教授课题组在《自然∙通讯》（Nature communications）上发表了题为“A natural timeless polymorphism allowing circadian clock synchronization in white nights”的文章[4]。研究了生物钟基因timeless基因多态性对温度导引生物钟的影响， 揭示了携带光不敏感型蛋白（LS-TIM）的果蝇更易于在高维度地区夏季长光照环境中生存。因此由光敏感型S-TIM向不敏感型LS-TIM的演进，有益于果蝇由赤道地区向高维度地区定向扩散。
作者在前期实验中，发现不同遗传背景的野生型果蝇在长光照（constant light，LL）和温度周期（16 ̊c:25 ̊c，TC）条件下的运动行为节律存在明显差异：一些野生型果蝇在此条件下不能很好地被温度同步。进一步通过PCR 鉴定发现，这些不能被温度同步化的果蝇往往都携带s-tim 等位基因，反之则携带ls-tim等位基因。Ls-tim是近年来（300-3000年前出现[7]）在欧洲中北部果蝇中出现的新亚型：通过在tim 5’上游一个鸟嘌呤插入，造成移码突变，产生了一个比原先TIM蛋白（S-TIM）长23个氨基酸的蛋白（L-TIM）[5-6]。为更好的比较两个等位基因引起的表型差异，研究者通过遗传回交实验将两种等位基因置于相同的遗传背景中，与预期结果一致，他们发现携带s-tim等位基因的果蝇在长光照条件下无法被温度周期导引，而呈现运动戒律紊乱（图1）。为了研究这种行为差异是否与光照条件相关，研究者们在避光条件下重复了该实验，结果显示s-tim、ls-tim引起的表型差异消失，因此温度介导的s-tim果蝇运动节律紊乱仅在长光照条件下存在。综上：S-TIM 影响了果蝇在长光照温度周期条件下运动节律。
图1 携带s-tim等位基因的果蝇无法在长光照条件下被温度同步化
（图源：Lamaze A, et al., Nat Commun, 2022）
果蝇的运动节律受到脑部表达生物钟基因的神经元（也将其统称为生物钟神经元）的调控。那么携带s-tim果蝇的节律紊乱是否预示着某些生物钟神经元存在节律失调？免疫染色显示，s-tim果蝇脑部控制运动节律的神经元在温度变化条件下显示强烈震荡节律：其中TIM蛋白在六点钟（ZT6）开始积累并在六小时后达到顶峰。而与之相反，s-tim果蝇中TIM的表达量始终处于较低水平，仅在LNd和 5th LNV存在周期性变化，并且与ls-tim果蝇相比，存在6小时相位差异（图2）。PER蛋白的染色结果也有相似结果。那么s-tim果蝇运动节律丧失是否是由于生物钟蛋白TIM 和PER 在相关神经元中持续低表达所致？为验证这一猜测，作者利用遗传挽救试验，在s-tim果蝇的生物钟神经元中过表达ls-tim，发现此时果蝇在长光照温度周期变化条件下的运动节律恢复正常（图3）。这些结果表明：s-tim果蝇的运动节律紊乱正是由于生物钟神经元TIM 表达量低且丧失震荡所导致的。
图2 在长光照和温度周期下TIM 和PER的昼夜震荡
（图源：Lamaze A, et al., Nat Commun, 2022）
图3 在生物钟神经元中表达ls-tim可以挽救s-tim果蝇在温度周期下的运动节律紊乱。
（图源：Lamaze A, et al., Nat Commun, 2022）
那么，为何s-tim 果蝇中TIM 的表达量持续维持在低水平呢？先前的研究表明， 在光照条件下，CRY与S-TIM的亲和力与LS-TIM与CRY的亲和力相比更强，从而募集更多的泛素连接蛋白JET，使S-TIM 更易于被降解[6]。结合s-tim果蝇仅在长光照条件下出现无法被温度同步化的结果，作者假设CRY介导的TIM降解是s-tim神经元中TIM表达水平低的原因。为了验证这一假设，作者在s-tim果蝇中引入cry突变体（cry02）来敲除内源性CRY的表达。免疫染色结果显示，TIM 和PER表达水平在几乎所有的生物钟神经元中显著上升，并出现震荡变化，几乎达到与ls-tim果蝇一致的水平，并且其运动节律也恢复正常（图4）。
图4 在s-tim果蝇中敲降CRY可以挽救在温度周期下的运动节律紊乱。
（图源：Lamaze A, et al., Nat Commun, 2022）
最后，由s-tim向ls-tim的进化是否具有生物学意义？昼夜温度变化在这一过程中是否起到推动作用？在北欧一些高纬度地区（如芬兰的奥卢）的夏季，平均光长时间可长达19-22小时，但同时昼夜温度变化却在10度以上，因此，温度与光相比，在这些高纬度地区更具有授时因子的性质。携带光不敏感的ls-tim果蝇可通过温度变化来校准体内生物钟，从而在这样的环境下具有振幅更强的生物钟，因而更具备生存优势。作者在实验室中模拟了奥卢地区夏季的环境条件（光照：1-200lux；温度：12-19 ̊c，详见图5a），并检测了携带不同timeless 等位基因果蝇的运动节律。发现只有携带ls-tim的果蝇可以适应这种类半自然（semi-natural）环境，显示出节律性变化的运动模式，所有携带s-tim 的果蝇的运动节律则杂乱无章，与timless基因敲除突变体表型类似。而在s-tim遗传背景下引入cry 突变体，则可挽救表型，使得该果蝇（s-tim;cry02）显示出类似ls-tim果蝇的运动节律。这些研究结果表明：果蝇timeless 由s-tim 向ls-tim的演变对果蝇由原本生活的赤道附近向两极方向扩张有重要的生物学意义，即LS-TIM蛋白的出现使果蝇能够抵抗长时间光照导致的TIM蛋白快速降解的隐患，从而使携带ls-tim的果蝇更加适合在高纬度地区生存。
图5 在类自然条件下不同遗传背景的果蝇的运动节律
（图源：Lamaze A, et al., Nat Commun, 2022）
碍于篇幅和时间限制，其他相关重要问题并未在本报道中涉及，例如：当果蝇长期曝露于日光下，其生物钟会停滞，这是由于TIM蛋白的持续降解所致，然而温度周期却可以使得TIM及其他核心生物钟蛋白恢复振荡，重启生物钟。其具体的分子机制目前尚不清楚。另外，通过对其他生活在高维度地区果蝇品系的研究发现，Drosophila virilis 通过降低光受体CRY在LNV神经元中的表达以维持生物钟在长光照下正常运转[7]。目前仍不清楚在D.virilis中是否存在timeless多态性，以及该果蝇是否能够被温度周期同步，但这些研究提示不同物种采用不同的策略来达到同一目的，两种策略的优劣尚未可知。这些问题有待后续研究进行解答。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-29293-6
第一作者并讯作者Angelique Lamaze博士（左），通讯作者陈骋昊博士（中），通讯作者Ralf Stanewsky教授（右）
（照片提供自Ralf Stanewsky实验室）
Ralf Stanewsky 实验室的研究方向为：生物节律的分子和神经机制，尤其是环境因子与生物钟相互作用的分子机制。实验室网页：http://stanewsky.uni-muenster.de/home。
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【7】PNAS︱钙激活钾离子通道BK在失神癫痫和运动障碍中的神经机制
【8】STAR Protocols︱脑内定点给药研究奖赏搜索行为机制的方案
【1】膜片钳与光遗传及钙成像技术研讨会 5月14-15日 腾讯会议
【2】科研技能︱第四届近红外脑功能数据分析班（线上：2022.4.18~4.30）
【3】科研技能︱磁共振脑网络分析入门班（线上：2022.4.6~4.16）
参考文献（上下滑动阅读）
1. Sehadova, H. et al. Temperature entrainment of Drosophila’s circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron 64, 251–266 (2009).
2. Chen, C. et al. Drosophila Ionotropic receptor 25a mediates circadian clock resetting by temperature. Nature 527, 516–520 (2015).
3. Yadlapalli, S. et al. Circadian clock neurons constantly monitor environmental temperature to set sleep timing. Nature 555, 98–102 (2018).
4. Lamaze A, Chen C, Leleux S, Xu M, George R, and Stanewsky R (2021) A natural timeless polymorphism allowing circadian clock synchronization in “white nights.” bioRxiv. doi:10.1101/2020.03.27.011361.
5. Tauber E, Zordan M, Sandrelli F, Pegoraro M, Osterwalder N, Breda C, Daga A, Selmin A, Monger K, Benna C, et al. (2007) Natural selection favors a newly derived timeless allele in Drosophila melanogaster. Science 316:1895-1898.
6. Sandrelli F, Tauber E, Pegoraro M, Mazzotta G, Cisotto P, Landskron J, Stanewsky R, Piccin A, Rosato E, Zordan M, et al. (2007) A molecular basis for natural selection at the timeless locus in Drosophila melanogaster. Science 316:1898-1900.
7. Zonato V, Vanin S, Costa R, Tauber E, and Kyriacou CP (2018) Inverse European latitudinal cline at the timeless locus of Drosophila melanogaster reveals selection on a clock gene: population genetics of ls-tim. J Biol Rhythms 33:15-23.
8. Menegazzi P, Dalla Benetta E, Beauchamp M, Schlichting M, Steffan-Dewenter I, and Helfrich-Förster C (2017) Adaptation of circadian neuronal network to photoperiod in high-latitude European Drosophilids. Curr Biol 27:833-839.
制版︱王思珍
本文完